วันที่ 29 กันยายน 2541 สองเดือนให้หลังเหตุการณ์ของเรซิเดนต์อีวิลภาคแรก[18] ที่ชุมชนในแร็กคูนซิตี[19] แถบภูเขาภาคตะวันตกกลางของสหรัฐ ประชาชนเกือบทั้งหมดถูกทำให้กลายเป็นซอมบีด้วยทีไวรัส อาวุธชีวภาพที่บริษัทเภสัชกรรม อัมเบรลลา พัฒนาอย่างลับ ๆ[20][21] ลีออน เอส. เคนเนดี เจ้าหน้าที่ตำรวจผู้ปฏิบัติหน้าที่วันแรก และแคลร์ เรดฟิลด์ นักศึกษาที่กำลังตามหาพี่ชายชื่อคริส เดินทางไปกรมตำรวจแร็กคูน[20] พวกเขาพบว่าตำรวจส่วนใหญ่ถูกฆ่าแล้ว[22] และคริสออกจากเมืองเพื่อไปสำรวจสำนักงานใหญ่ของอัมเบรลลาในทวีปยุโรป[23] ทั้งสองแยกกันหาผู้รอดชีวิตและหาทางหนีออกจากเมือง[24][25] ขณะหาทางออกอยู่นั้น แคลร์พบกับเด็กหญิงชื่อเชอร์รี เบอร์กินที่กำลังหนีจากสิ่งมีชีวิตลึกลับ และลีออนพบกับเอดา วอง ซึ่งอ้างว่ากำลังตามหาคนรักชื่อจอห์น นักวิจัยของอัมเบรลลา[24][26]

หัวหน้าตำรวจแร็กคูนซิตี ไบรอัน ไอร์เอินส์ รับสินบนจากอัมเบรลลาให้ซ่อนหลักฐานเกี่ยวกับการทดลองของบริษัทที่อยู่นอกเมือง เขายังปกปิดการพัฒนาจีไวรัสใหม่ ซึ่งเป็นสารที่สามารถกลายพันธุ์มนุษย์ให้เป็นอาวุธชีวภาพสุดยอดได้[24][27] ลีออนเผชิญหน้าหลายครั้งกับสัตว์ประหลาดไทแรนต์ที่อัมเบรลลาปล่อยทางอากาศสู่กรมตำรวจแร็กคูนเพื่อแสวงจีไวรัส ไอร์เอินส์พยายามฆ่าแคลร์แต่ถูกมนุษย์กลายพันธุ์จากจีไวรัสตัวหนึ่งฆ่าเสียก่อนในสถานีตำรวจ จากนั้นแคลร์และเชอร์รีหลบหนีทางท่อน้ำทิ้งและพลัดหลงกัน หลังจากเอดาแยกทางกับลีออน เอดาพบกับเชอร์รีและเก็บสร้อยคอทองที่เชอร์รีทำหล่นไว้ขณะวิ่งหนีได้ ในท่อน้ำทิ้ง เอดากลับมารวมตัวกับลีออนอีกครั้งอย่างไม่เต็มใจหลังจากลีออนยืนกรานว่าเขามีหน้าที่ต้องปกป้องเธอ ทั้งสองพบกับผู้หญิงวัยกลางคนคนหนึ่งที่ยิงปืนใส่เอดาแต่ลีออนกระโดดรับกระสุนแทน เอดาปล่อยลีออนที่สลบไว้และตามผู้หญิงคนนั้นไป ซึ่งต่อมาเผยว่าเธอคือ แอนเนตต์ แม่ของเชอร์รี และภรรยาของวิลเลียม เบอร์คินส์ นักวิทยาศาสตร์ของอัมเบรลลาผู้สร้างจีไวรัส เขาฉีดเชื้อใส่ตัวเองเพื่อพยายามปกป้องผลงานของเขาจากหน่วยพิเศษที่สำนักงานใหญ่อัมเบรลลาส่งมา และทำให้เขากลายเป็นสัตว์ประหลาดผิดรูป "จี" ที่ตามล่าเชอร์รี[24] แอนเนตต์จำสร้อยคอของลูกสาวได้ และพยายามคว้ามาจากเอดา เกิดการต่อสู้ขึ้น และแอนเนตต์ถูกโยนข้ามลูกกรง[28] เอดารับทราบว่าสร้อยคอท้องคำบรรจุตัวอย่างเชื้อจีไวรัสไว้ และต่อมา เธอกลับไปที่ลีออน และรักษาแผลถูกกระสุนปืนให้ลีออน หลังอารมณ์เป็นฝ่ายชนะ[20][24]

ขณะเดียวกัน แคลร์กลับมาพบเชอร์รีอีกครั้งและพบว่า "จี" ปลูกฝังตัวอ่อนไว้ที่ลูกสาวพื่อผลิตลูกหลาน ลีออน เอดา แคลร์ และเชอร์รีมุ่งหน้าไปที่โรงงานร้างที่เชื่อมต่อกับสถานีวิจัยลับใต้ดินของอัมเบรลลา เบอร์คินทำร้ายเอดาจนบาดเจ็บสาหัส ส่วนลีออนสำรวจห้องทดลองเพื่อหาทางรักษาบาดแผลของเอดา[24] แอนเนตต์ที่มีอาการทางจิตขัดจังหวะลีออน และอธิบายเขาว่าความสัมพันธ์ระหว่างเอดากับจอห์นเป็นเพียงการล้วงข้อมูลของอัมเบรลลา เอดาเป็นสายลับที่ถูกส่งมาขโมยจีไวรัสให้กับองค์กรที่ไม่รู้จัก[24][29] ขณะที่แอนเนตต์กำลังจะยิงลีออน สัตว์ประหลาดไทแรนต์ปรากฏตัวและบังคับเธอให้ถอย เอดากลับไปช่วยลีออนและสู้ชนะไทแรนต์ได้ ซึ่งตกลงไปในบ่อโลหะหลอมละลาย แต่ดูเหมือนว่าต้องแลกด้วยชีวิตของเธอ เธอสารภาพรักกับลีออนก่อนที่เขาจะทิ้งร่างที่ไม่ไหวติงของเธอไว้ ขณะเดียวกัน แอนเนตต์พยายามหนีไปพร้อมกับตัวอย่างจีไวรัสอีกอันหนึ่งแต่ถูกสามีที่กลายพันธุ์ทำร้ายจนเสียชีวิต ทว่าก่อนเสียชีวิตเธอบอกวิธีสร้างวัคซีนซึ่งจะหยุดการกลายพันธุ์ที่เกิดจากตัวอ่อนในตัวเชอร์รี หลังเตรียมยารักษาแล้ว ลีออนกับแคลร์กลับมาพบกันที่รถไฟหลบหนีฉุกเฉิน และฉีดวัคซีนให้เชอร์รีและช่วยชีวิตเธอไว้ ระหว่างทางลีออนได้รับความช่วยเหลือในการกำราบไทแรนต์ที่กลายพันธุ์แล้วจากหญิงในเงามืดและหลบหนีไปพร้อมกับจีไวรัสในสร้อยคอ[24][30] "จี" ซึ่งปัจจุบันกลายพันธุ์เป็นกลุ่มเนื้อและฟันเกาะกัน ไล่กวดลีออนกับแคลร์ แต่ถูกทำลายเมื่อด้วยระบบระเบิดตนเองของรถไฟ[24] หลังหนีออกจากเมืองได้ ลีออนตั้งใจโค่นบริษัทอัมเบรลลา ขณะที่แคลร์ยังคงตามหาพี่ชายต่อไป[24][31] ฮังก์ เจ้าหน้าที่พิเศษคนหนึ่งที่อัมเบรลลาส่งมา สำเร็จภารกิจการเก็บกู้จีไวรัส[30]